【摘要】 目的 研究血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆障碍及发病机制。方法 4血管阻断法制作模型，Morris水迷宫法检测学习记忆能力，免疫组化法观察Bcl2和Bax表达，流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率，亚甲蓝比色法检测血清中H2S含量。结果 模型组大鼠学习记忆能力明显减退。Bcl2/Bax在缺血再灌注(I/R)开始时升高，随后开始下降。模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加。模型组大鼠血清中H2S含量明显减少。血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率间呈明显负相关。 结论 VD可导致学习记忆障碍，海马神经细胞凋亡和血清中H2S含量减少;海马神经细胞凋亡程度可能与内源性H2S生成减少有关。
【关键词】 血管性痴呆;学习记忆;免疫组化;流式细胞术;硫化氢
血管性痴呆(VD)是老年期痴呆的主要类型之一，它是由一系列脑血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等)导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征〔1〕，不仅给病人带来长期痛苦，严重影响其生活质量，而且给家庭、社会造成沉重负担，因此研究VD的发病机制以指导其防治具有很高的社会价值和现实意义。H2S是第三类气体信号分子，广泛参与机体的多种生理和病理过程，为进一步了解其在VD发病中的作用，本研究观察大脑缺血/再灌注(I/R)不同时间对大鼠学习记忆能力的影响、血清中H2S含量改变及海马CA1区神经细胞凋亡情况，从行为学、细胞凋亡及内源性H2S表达量及其相互关系等方面，探讨VD的发病机制，为其防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 健康Wistar雄性大鼠64只，体重300～350 g(由河北省实验动物中心提供)，随机分为8组，正常组，假手术组和VD模型组，VD模型组又分为大脑I/R 2，8，24，72，168和720 h组，每组8只动物。
1.2 动物模型制备 4血管阻断法(4VO法)〔2〕建立VD大鼠模型。假手术组麻醉及手术过程与VD模型组相同，但不电凝双侧椎动脉，不阻断双侧颈总动脉。术后按再灌注的不同时间分别将动物处死,经主动脉依次灌注生理盐水100 ml和4%多聚甲醛500 ml，取出脑组织，石蜡包埋切片，用于免疫组化显示Bcl2、Bax及苏木素伊红(HE)染色。
1.3 学习记忆能力的测定 Morris水迷宫检测〔3〕：实验开始于VD术后4 w，预先将迷宫任意分为4个象限。平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中，在大鼠游泳池边标记4点作为大鼠的入水点，记录120 s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。记录各组大鼠的逃避潜伏期，作为学习记忆能力检测指标。
1.4 取材 大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg体重)腹腔注射麻醉后，快速开胸暴露心脏，心尖取血4～5 ml，分离血清，用于血清H2S含量测定;然后断头处死，并立即在冰台上开颅，迅速分离大鼠海马，用70%酒精固定，4℃冰箱保存过夜，用于流式细胞术检测。
1.5 HE染色 切片常规脱蜡至水→1%盐酸酒精分化→伊红染色2 min→切片常规梯度酒精脱水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性树胶封固。
1.6 免疫组化染色(SP法) Bax兔抗鼠多克隆抗体，Bcl2兔抗鼠多克隆抗体(Santa Cruz公司生产)。
1.7 流式细胞术检测 采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXL Ⅱ型流式细胞仪。
1.8 血清中H2S含量的检测 亚甲蓝分光光度法。
1.9 统计学处理 用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。
2 结 果
2.1 学习记忆能力检测结果 各组大鼠在迷宫各入水点搜索平台的结果见表1，随着训练天数的增加，各组大鼠的逃避潜伏期均缩短，第2天I/R 720 h组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期明显延长(P<0.01);正常组和假手术组逃避潜伏期差异不显著(P>0.05)。
2.2 VD大鼠病理形态学结果 HE染色后，神经细胞胞浆呈淡红色，核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，细胞完整，结构正常，胞浆丰富，胶质细胞无增生;细胞核呈圆形、椭圆形，无变性，无固缩或溶解现象。VD模型组海马CA1区神经元排列紊乱，神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限不清，核固缩成三角形或不规则形，而且随I/R时间的延长，变性神经元数目越多，见图1。 表1 各组逃避潜伏期比较
2.3 凋亡蛋白表达结果
2.3.1 VD大鼠模型海马CA1区Bcl2表达 VD模型组I/R 2 h Bcl2蛋白平均OD值开始明显上调，I/R 8 h达到高峰，之后随I/R时间的延长开始下降，但I/R 24 h组仍高于假手术组。假手术组与I/R不同时间点组间，Bcl2的表达情况均有显著差异(P<0.01)(表2)。
2.3.2 VD大鼠模型海马CA1区Bax的表达 I/R早期Bax在海马CA1区的表达明显增强，随着再灌注时间的延长，其表达量不断增加，I/R 72～168 h达高峰。假手术组与I/R不同时间点组之间，Bax的表达均有显著差异(P<0.01)(表2)。
2.3.3 Bcl2/Bax比率变化 随I/R时间的延长，Bcl2/Bax的比率逐渐降低(表2)。表2 VD大鼠Bcl2、Bax的表达水平与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01
2.4 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率结果 随着I/R时间的延长，大鼠海马神经细胞凋亡率逐渐增高，其中I/R 2 h组凋亡率最低，I/R 168 h组凋亡率最高。VD模型各时间组与假手术组比较，海马神经细胞凋亡率明显增加(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较，各组间海马神经细胞凋亡率均差异显著(P<0.01)，见表3。
2.5 血清H2S含量检测结果 随着I/R时间的延长，大鼠血清H2S含量呈现直线降低趋势，其中IR 2 h组血清H2S含量最高，I/R 168 h组血清H2S含量最低。VD模型各时间组与正常组和假手术组比较，血清H2S含量明显减少(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较，血清H2S含量均差异显著(P<0.01);正常组和假手术组血清H2S含量无显著差异(P>0.05)，见表3。
2.6 血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析 随着血清H2S含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者呈现明显的负相关，回归方程为：y=-0.135x+12.068，相关系数r=-0.861(P<0.01)，提示内源性H2S可能具有保护神经细胞的功能。表3 各组海马神经细胞凋亡率及血清H2S含量(各组间两两比较：1)P<0.01
3 讨 论
目前认为，I/R后神经元死亡的机制是损伤级联反应，脑缺血性损伤级联反应大多以能量衰竭和兴奋性氨基酸毒性开始，以细胞凋亡结束。本实验中用HE染色观察到海马CA1区大量细胞呈现明显的凋亡特征，VD模型组大鼠海马CA1区可见神经元排列紊乱，神经元变性，体积变小，核固缩成三角形或不规则形，胞核与胞浆界限不清。流式细胞术检测海马神经细胞的凋亡率发现VD模型各组与假手术组相比海马神经细胞凋亡率明显增加，而且随着I/R时间的延长，大鼠海马神经细胞的凋亡率逐渐增加。
在参与调控神经元凋亡的基因和蛋白质产物中，一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl2，BclxL，Bclω，Al等;另一类是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bad等〔4〕。体外研究显示〔5〕：Bcl2保护细胞免于各种损伤。本实验结果显示VD模型组I/R 2 h后Bcl2蛋白平均光密度值开始明显上调，IR 8 h达到高峰，之后开始下降，但IR 72 h仍高于假手术组;而Bax蛋白在I/R早期在海马CA1区的表达明显增强，且随着再灌注时间的延长，其表达不断增加。Bcl2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡两类蛋白的比例即Bcl2/Bax的比率决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡〔6〕，本次研究显示Bcl2/Bax的比率随I/R时间的延长逐渐降低，而大鼠海马神经细胞的凋亡率则逐渐增加，这也从另一方面证实了Bcl2蛋白的抗凋亡作用。
VD主要表现为学习记忆能力的降低，而海马是学习记忆的重要结构，I/R损伤后海马区的神经细胞凋亡势必对学习记忆功能产生重要的影响。本研究利用Morris水迷宫技术对VD模型大鼠的空间学习记忆能力进行测试，发现I/R 720 h组较正常组和假手术组的逃避潜伏期明显延长，表明VD可造成大鼠学习记忆功能障碍，其机制可能是I/R损伤引起海马神经细胞凋亡，从而导致海马学习记忆功能障碍。
H2S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的另一种具有神经调节作用的新型气体信号分子〔7〕，H2S不仅在神经系统发挥重要的生理作用，而且还可作为一种内源性的抗氧化剂，在氧化应激时能够清除羟自由基等活性氧簇〔8，9〕，具有抗氧化、恢复认知功能、调节脑血流量等作用，也提示H2S可能也参与老年痴呆动物或病人神经元的保护〔10〕。本研究结果显示随着大脑I/R时间的延长，各组大鼠血清H2S含量均减少，而海马CA1区凋亡神经细胞数逐渐增加;随着血清H2S含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者间呈现明显的负相关关系，提示内源性H2S对脑I/R损伤中的神经细胞具有保护作用，可以减少细胞凋亡的发生。关于H2S发挥保护作用的机制尚不十分清楚，有研究表明，对于体外培养的心肌细胞，H2S可通过直接清除H2O2和O2而减少脂质过氧化产物MDA的生成〔11〕;对于神经细胞，H2S可抑制过氧亚硝酸盐介导的细胞毒性作用，抑制细胞内蛋白质分子的氧化和硝基化〔8〕，或者通过促进还原型谷胱甘肽的产生而对抗氧化应激损伤〔9〕，H2S被证实可激活ATP敏感的K通道(KATP)〔12〕，从而起到细胞保护作用。综上所述，I/R损伤可引起内源性H2S含量降低，从而导致海马神经细胞凋亡率升高;I/R损伤后大鼠学习记忆功能障碍是海马神经细胞凋亡的必然结果。因此，提供外源性H2S或H2S供体以降低海马神经细胞凋亡率可能是治疗VD的新方法。
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